Optimización de cómodas máquinas de PCR en tiempo real

Si se trata de una PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real para la cuantificación de virus y el genotipado de SNP, necesitamos una máquina de PCR con la mayor especificidad posible;si se trata de detección de patógenos y ARNm, necesitamos una alta sensibilidad máquina de PCREntonces, ¿cómo deberíamos optimizar esta máquina de PCR?

Aquí está la lista de contenidos:

l Mejora de la eficiencia de amplificación de la máquina de PCR

l Uso de cebadores de máquinas de PCR en tiempo real para PCR general

Mejora de la eficiencia de amplificación de la máquina de PCR

Mejorar la máquina de PCR Eficiencia, especificidad y sensibilidad de amplificación, podemos optimizar la máquina de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real para el experimento a través de una serie de medidas.El primero es la selección de la secuencia objetivo.

1, la elección de la secuencia objetivo de la máquina de PCR en tiempo real conveniente tiene una longitud adecuada entre 50 y 150 pb.Las secuencias más cortas tardan menos en sintetizarse y tienen tiempos de amplificación más cortos, por lo que se reduce la posibilidad de contaminar el ADN que se amplifica.

2. Al seleccionar la secuencia objetivo, utilice la búsqueda BLAST para analizar la secuencia objetivo en busca de polimorfismos y errores de secuenciación y evitarlos.Si hay secuencias duplicadas en la secuencia objetivo, se reducirá la sensibilidad de detección de esta máquina de PCR y también se debe evitar.

3, controle el contenido de GC ≤ 60% en la secuencia objetivo.El alto contenido de GC afectará la desnaturalización de la secuencia objetivo en el ciclo térmico, pero también será fácil producir esta amplificación no específica de la máquina de PCR.

4, evite generar estructura secundaria.Las secuencias diana con secuencias repetitivas inversas son fáciles de producir en una estructura secundaria, lo que afecta la hibridación de cebadores y sondas convenientes de las máquinas de PCR en tiempo real.

Además de esto, también debemos asegurarnos de que la calidad de la plantilla no afecte la amplificación y que los resultados de la conveniente máquina de PCR en tiempo real sean confiables.Por ejemplo, el ADN dañado no puede amplificarse adecuadamente en la máquina de PCR o no puede amplificarse en absoluto.Además, la presencia de reactivos inhibidores de la ADN polimerasa (DMSO, etc.) y contaminantes (SDS, etc.) en la plantilla puede afectar la confiabilidad de los resultados de amplificación de la máquina de PCR.

Uso de cebadores de máquinas de PCR en tiempo real para PCR general

Obtenga comodidad en tiempo real máquina de PCR cebadores, este método también se puede utilizar para la PCR ordinaria.

1. La longitud debe ser de 18 a 30 pb para garantizar la especificidad de la unión.

2. La temperatura de fusión (valor Tm) debe ser de 55 a 60 °C y los valores de Tm de los dos cebadores deben diferir en 2 a 3 °C.

3. Cada cebador debe tener de 1 a 3 guaninas o citosinas en el extremo 3', lo que puede reducir convenientemente la amplificación no específica durante la máquina de PCR en tiempo real.Más de 3 serán contraproducentes y provocarán un 'efecto deslizante' que conducirá a la extensión incorrecta.

4. El contenido de GC de los cebadores debe ser de alrededor del 50 %, un contenido de GC demasiado alto aumentará el valor de Tm.

5, los cebadores de la máquina de PCR deben evitar secuencias repetitivas inversas, ya que formarán una estructura secundaria que afectará la unión del cebador a la plantilla.

6. Si se trata de RT-PCR, también debe evitar diseñar cebadores para que se unan a secuencias de exones, lo que conducirá a resultados experimentales de la máquina de PCR falsos positivos.El enfoque correcto debe diseñarse en el flanco del intrón largo, o en los intrones cortos, o a través de la región de unión exón-exón.

7. Desalado y depuración de las imprimaciones.

Tenga en cuenta que a veces, cuando haya realizado todos los puntos, es posible que los cebadores no se amplifiquen, por lo que deberá rediseñarlos.

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