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Optimización de máquinas de PCR en tiempo real convenientes.

Número Navegar:0     Autor:Editor del Sitio     publicar Tiempo: 2021-11-24      Origen:motorizado

Optimización de máquinas de PCR en tiempo real convenientes.

Si es la PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real para la cuantificación del virus y la genotipificación SNP, necesitamos una máquina PCR con la especificidad más alta posible; Si es patógeno y detección de ARNm, necesitamos una alta sensibilidad.Máquina de PCR, Entonces, ¿cómo deberíamos optimizar esta máquina de PCR?

Aquí está la lista de contenido:

l Mejorando la eficiencia de la amplificación de la máquina PCR

L Usando cebadores de la máquina PCR en tiempo real para PCR general

Mejora de la eficiencia de la amplificación de la máquina PCR

Mejorarla máquina de PCREficiencia, especificidad y sensibilidad de la amplificación, podemos optimizar la máquina PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real para el experimento a través de una serie de medidas. La primera es la selección de la secuencia de destino.

1, la elección de la secuencia de objetivo de la máquina de PCR en tiempo real conveniente Longitud apropiada entre 50 y 150 PP. Las secuencias más cortas toman menos tiempo para sintetizar y tienen tiempos de amplificación más cortos, por lo que se reduce la posibilidad de contaminar el ADN que se amplifica.

2, Al seleccionar la secuencia de destino, use BAST Búsqueda para analizar la secuencia de destino para los polimorfismos y errores de secuenciación y evitarlos. Si hay secuencias duplicadas en la secuencia de destino, reducirá la sensibilidad de detección de esta máquina de PCR y también debe evitarse.

3, controle el contenido de GC ≤ 60% en la secuencia de destino. El alto contenido de GC, afectará la desnaturalización de la secuencia de destino en el ciclo térmico, pero también fácil de producir esta amplificación no específica de esta máquina de PCR.

4, Evite generar estructura secundaria. Las secuencias de destino con secuencias repetitivas inversas son fáciles de producir estructura secundaria, lo que afecta la hibridación de cebadores y sondas convenientes de la máquina de PCR en tiempo real.

Además de esto, también debemos garantizar que la calidad de la plantilla no afectará la amplificación, los resultados de la máquina de PCR en tiempo real convenientes tienen confiabilidad. Por ejemplo, el ADN dañado no se puede amplificar adecuadamente en la máquina PCR, o no amplificarse en absoluto. Además, la presencia de reactivos inhibidores de la polimerasa de ADN (DMSO, etc.) y contaminantes (SDS, etc.) en la plantilla puede afectar la confiabilidad de los resultados de la amplificación de la máquina PCR.

Usando cebadores de la máquina de PCR en tiempo real para PCR general

Obtener conveniente en tiempo realMáquina de PCRLos cebadores, este método también se puede utilizar para PCR ordinario.

1, la longitud debe ser de 18-30BP para garantizar la especificidad de la unión.

2, la temperatura de fusión (valor TM) debe ser de 55-60 ° C, y los valores TM de los dos cebadores deben diferir en 2-3 ° C.

3, cada cebador debe tener 1 a 3 guaninas o citosinas en el extremo 3 ', que puede reducir convenientemente la amplificación no específica durante la máquina de PCR en tiempo real. Más de 3 se incendiarán y causará un \"efecto deslizante\" que conduzca a la extensión incorrecta.

4. El contenido de GC de los cebadores debe ser de alrededor del 50%, el contenido de GC demasiado alto aumentará el valor TM.

5, los cebadores de la máquina de PCR deben evitar secuencias repetitivas inversas, ya que formará una estructura secundaria, afectando la unión al cebador en la plantilla.

6, si es RT-PCR, también debe evitar diseñar cebadores para unirse a las secuencias de exón, lo que conducirá a resultados experimentales de la máquina de PCR falsos positivos. El enfoque correcto debe diseñarse en el flanco de intrón largo, o intrones cortos, o en la región de la unión del exón-exón.

7. Desalear y purificar los cebadores.

Tenga en cuenta que a veces, cuando haya realizado todos los puntos, los cebadores pueden no amplificar, por lo que debe rediseñar los cebadores.

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